酵母ppic9k载体能表达植物来源的基因
典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115菌株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
1.2.5转化农杆菌的PCR鉴定采用文献［4］的方法分别提取农杆菌（EHA105，GV3101）中的mini?Ti质粒，用预先设计的引物进行PCR扩增鉴定，获得可用于遗传转化的农杆菌.
2结果
2.1PCR方法获取hIL?12基因片段以质粒pCA13?hIL?12为模板，运用PCR方法获得全长hIL?12基因（1613 bp，图2）.
2.2重组质粒pBI121?hIL?12的鉴定经限制性内切酶SmaI，SacI酶切后得到大小约1600 bp和12800 bp的大片段，表明hIL?12已经克隆到质粒pBI121中（图3）. 质粒送上海生工生物工程公司进行全长测序鉴定，通过序列比对分析发现，目的基因与GenBank中已发表的基因序列完全一致，表明植物表达载体pBI121?hIL?12构建成功.
2.3转化农杆菌的PCR检测从三亲融合后的农杆菌中提取mini?Ti质粒，进行PCR扩增，扩增出大小约1600 bp的片段，与来自大肠杆菌DH5α中的重组质粒pBI121?hIL?12为模板的PCR产物一致，而对照空载根癌农杆菌单菌落为空白，表明获得了2种含hIL?12基因的植物表达载体的农杆菌（图5）.
3讨论
hIL?12是相对分子质量为75 ku的蛋白质，由不同基因编码的2个亚基P35与P40两条肽链通过二硫键结合在一起的异二聚体，研究表明，细胞必须同时表达这两个基因才能产生有活性的IL?12. 我们选用的质粒pCA13?hIL?12中的hIL?12基因就是利用这两个亚基具有独立的基因序列特点，将hIL?12两个亚单位进行融合，中间插入一个linker序列，以保证其基因产物具有正确的蛋白结构及等比例的表达.
实验中选用的载体pBI121是一个常用的植物表达载体，多克隆位点上游带有CaMV35S启动子，在植物组织中能启动外源基因的表达，下游带有GUS报告基因，由于酶切位点的要求，本实验的GUS已被切除，切除了GUS报告基因，给转化子的筛选带来了不便，但这一缺憾可以通过特异性引物进行PCR检测来弥补；在NOS启动子下游带有NPTII基因，可进行Kanamicin抗性筛选.
Mason等［5］提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想. 我们构建的植物表达载体pBI121?hIL?12，可以用于马铃薯、烟草、番茄等植物的转化，从而为用植物作为生物反应器生产药用蛋白提供实验基础. 目前，将hIL?12基因转入马铃薯的工作正在进行中. 我们成功构建了hIL?12基因的植物表达载体，为最终实现用植物生产hIL?12奠定了基础.
是整合型载体。常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。 与建立酿酒酵母基因工程表达系统类似，构建巴斯德毕赤酵母表达菌株的基本方法如下：
(1)经典遗传学操作方法（如突变体分离、互补分析、回交和单孢分析）；
(2)分子遗传学方法（如DNA转化、基因置换等。）为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株，巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。多拷贝表达菌株的获得方式有两种。一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。在发酵罐培养的产物选择压力下此两种方式获得的多拷贝表达菌株被证明是稳定的。
经同一表达载体转化后分离得到的不同转化子，其产物的表达水平不同。即使受体染色体上重组了相同数目的表达盒。转化子的表达情况也不近相同。因此，为了获得高产量的表达菌株，需要对大量的转化子进行筛选。小量摇瓶培养无疑是筛选转化子简便而有效的方法。但是由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。 包括：适宜的培养液缓冲系统及适当的发酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通气量；添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物以避免产物被蛋白酶降解并为外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但此时外源基因的表达被完全抑制。而当甘油缺失或被完全消耗时，甲醇被添加到培养液中，诱导产生外源蛋白。此阶段菌群生长迟缓，但产物表达旺盛。